要点
问题同步多发原发结直肠癌(sMPCC)的分子特征和临床特点是什么?
发现这项239例sMPCC患者的队列研究发现，sMPCC的缺陷错配修复(dMMR)/微卫星不稳定性高(MSI-H)频率明显高于单一原发性结直肠癌。sMPCC各病变的MMR/MSI状态可能不同，可分为3个亚组:全部dMMR/MSI- h、dMMR/MSI- h及熟练MMR (pMMR)/微卫星稳定性(MSS)、全部pMMR/MSS。
意义这些发现表明，sMPCC可以根据每个病变的MMR/MSI状态分为亚组，这可能用于指导个性化治疗，以更好地管理疾病。
重要性同步多发原发结直肠癌(sMPCC)临床上少见，但其发病率在过去十年中有所增加。然而，对sMPCC的分子和临床特征知之甚少，它可能与单原发结直肠癌(SPCRC)不同。
客观的目的探讨sMPCC的临床特点、病变的致病变异及分子分型。
设计、设置和参与者2012年11月至2021年4月，在中山大学附属第六医院治疗的结直肠癌(CRC)患者被纳入本队列研究。随访于2022年1月31日结束。
主要成果及措施主要结局是所有患者的每个病灶的错配修复(MMR)状态，使用免疫组化(IHC)进行检查。计算微卫星不稳定性(MSI)和肿瘤突变负荷(TMB)。
结果共纳入13 276例CRC患者，239例sMPCC患者(平均[SD]年龄，63.3[12.2]岁;173名男性(72.4%)进行了临床资料评估。78例sMPCC患者和94例SPCRC患者也进行了基于下一代测序(NGS)的分子检测。sMPCC的MMR (dMMR)/MSI-H缺失频率明显高于SPCRC，这在IHC(239例患者中50例vs 13例患者中872例)和NGS(78例患者中17例vs 94例患者中5例)中均得到证实。根据sMPCC患者不同病变的MMR/MSI状态，进一步分为3个亚组:全部dMMR/MSI- h组、dMMR/MSI- h组和MMR (pMMR)/微卫星稳定性(MSS)精通组、全部pMMR/MSS组。的表皮生长因子受体和PIK3CA变异更常见，而TP53与SPCRC患者相比，sMPCC患者的变异较少。此外，与SPCRC患者相比，sMPCC患者较高的肿瘤突变负担与较高的MSI相关。
结论与相关性在本sMPCC队列研究中，sMPCC患者dMMR/MSI-H的发生率明显高于SPCRC患者。这些结果表明，根据每个病变的MMR/MSI状态，sMPCC可以分为3个亚组，这可能用于指导个性化治疗，以更好地管理疾病。
同步多发原发结直肠癌(Synchronous multiple primary colorectal cancer, sMPCC)是一种相对罕见的结直肠癌(CRC)，是指同一患者在结肠或直肠同时发生2个或2个以上独立的原发恶性肿瘤。根据最近的报道，1，2尽管中国结直肠癌的患病率略低于美国，但自2000年以来，中国结直肠癌的年发病率和死亡率稳步上升，sMPCC的发病率也在上升。尽管不同地区的发病率略有不同，一项荟萃分析3.，4sMPCC在所有CRCs中的总发病率约为1.1% ~ 8.1%。由于发病率相对较低，缺乏对sMPCC的大规模研究。大多数关于sMPCC的研究集中在小样本的临床特征和流行病学上。4，5只有少数研究提供了sMPCC的全基因组特征，6，7据我们所知，目前尚无关于sMPCC的临床表型和分子特征的综合研究。
此外，随着免疫治疗在微卫星不稳定性高(MSI- h) CRC中的进展，错配修复(MMR)/MSI状态在CRC治疗中发挥着重要作用。目前尚不清楚不同sMPCC病变的MMR/MSI状态是否一致。
2020年4月，我们治疗了一名50多岁的sMPCCs和多发性肝转移患者。患者有3个肿瘤，分别位于升结肠(T3N2M1)、横结肠(T3N0M1)和直肠上部(T4aN2M1)。直肠病变的基因组测序显示患者具有MSI-H状态。因此，在充分评估病情并咨询患者后，我们实施了6个疗程的程序性死亡(PD) -1阻断(200mg /剂量)联合mFOLFOX6疗程间2周的转换策略。患者症状迅速缓解，腹腔镜全结肠及上直肠切除术如期实施，无延误。值得注意的是，患者所有胃肠道病变和淋巴结均有病理完全缓解。患者术后接受3次额外的PD-1阻断治疗(200mg /剂)。在随访期间，常规放射检查，包括计算机断层扫描、磁共振成像和超声造影，证明患者已超过18个月没有疾病状态的证据。在此病例的基础上，我们重点通过MMR和MSI状态以及sMPCC的致病变异来评估sMPCC的分子分型。我们对sMPCC进行了大规模的回顾性队列研究，以评估每个病变的临床特征和致病变异，并首次对sMPCC进行分子分型。
在涉及人类参与者的研究中执行的所有程序都符合机构和/或国家研究委员会的道德标准以及1964年的赫尔辛基宣言8以及后来的修订或类似的道德标准。本队列研究遵循《加强流行病学观察性研究报告》(选通脉冲)队列研究报告指南，方案经中山大学附属第六医院医学研究伦理委员会批准。所有患者均知情并签署知情同意书。
根据Warren和Gates标准，sMPCC的详细标准如下:(1)病理证实为腺癌，(2)相互分离，(3)排除原发CRC转移，(4)同时诊断或6个月内诊断。3.2012年11月至2021年4月，剔除临床资料不完整或无法随访的患者，纳入在中山大学附属第六医院手术的结直肠癌患者，包括sMPCC患者。我们对所有符合条件的sMPCC患者进行了回顾性单中心研究。CRC患者各病灶均行病理检查及免疫组化(IHC)。
使用医疗记录系统收集每个患者的治疗和基线信息。万博manbetx平台首页在研究期间，随访方法包括电话访谈、门诊检查和再入院。随访结束于2022年1月31日，即死亡发生时间。所有患者在术后最初每3个月随访一次，如无复发，从第3年到第5年每6个月随访一次。每次定期进行体格检查及血清癌胚抗原、碳水化合物抗原19-9检查，每半年复查一次计算机断层。
显微镜下检查整个肿瘤组织，并获得福尔马林固定，石蜡包埋的组织样本。切片用苏木精和伊红染色，厚度为4 μm。根据既定方案，使用抗MLH1 (MAXIM)、MSH2 (LBP)、MSH6 (ZSGB-BIO)和PMS2 (ZSGB-BIO)的单克隆抗体进行免疫组化分析。载玻片与一抗在4°C孵育过夜。应用MaxVisionTM HRP-Polymer山羊抗小鼠/兔免疫组化试剂盒(PV-6000, ZSGB-BIO)中的山葵过氧化物酶标记二抗，将载玻片在室温下孵育30分钟，然后在室温下与3,3 ' -二氨基联苯胺孵育5分钟。最后，切片用苏木精反染，并用Permount (BIOS)安装。结果由2名经验丰富的病理学家(Y. Zhao和S. Bai)进行可视化和解释。
使用Onco PanScan (Genetron Health Co, Ltd)对78例sMPCC的每个病变进行了有足够标本的靶向下一代测序(NGS)。简单地说，使用QIAamp DNA组织试剂盒(Qiagen)从肿瘤组织中提取总DNA。根据制造商的协议，使用KAPA HTP文库制备试剂盒(Illumina)构建DNA文库。使用FastQC(版本0.11.2)和Trimmomatic(版本0.33)进行质量控制。9使用BWA-MEM算法(version 0.7.10-r789)将生成的序列映射到人类基因组HG19。10肿瘤和正常样本均适用。聚合酶链式反应重复标记和删除使用Picard命令行工具版本1.103 (Broad研究所)。使用Genome Analysis Toolkit (GATK, version v3.1-0-g72492bb)进行碱基质量再校准和局部重组处理。11使用MuTect (version 3.1-0-g72492bb)鉴定体细胞单核苷酸变异和小插入/缺失。12和Strelka(版本1.0.14)。13使用变体效应预测器(83版)对变量的影响进行了注释。14Oncotator(版本1.5.1.0)。15体细胞拷贝数变异用ADTEx确定。16使用CREST确定结构变化。17通过计算309个微卫星站点的长度，利用NGS对MSI状态进行评价。肿瘤突变负担(TMB)值由3 427 939-bp编码区每兆酶的体细胞单核苷酸变异数和插入/缺失数决定。
采用SPSS统计软件26.0版(IBM)和R统计软件4.0.4版for Windows (R Project for Statistical Computing)进行统计分析。双尾P< 0.05被认为有统计学意义。根据数据分布特征，连续变量以均值(SD)或中位数(IQR)表示，分类数据以数字或百分比表示。组间连续变量比较采用t检验它们是否服从正态分布;否则，就是曼-惠特尼U采用非参数检验。分类变量用χ进行比较2或费雪精确检验。使用Kaplan-Meier方法对总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)进行生存分析，并使用log-rank检验进行评估。
图1中的图1补充1显示接受免疫治疗的sMPCC患者的治疗细节和随访情况。在目前的队列研究中，13 276名CRC患者和239名sMPCC患者(平均[SD]年龄，63.3[12.2]岁;173名男性(72.4%)进行了临床资料评估。78例sMPCC患者和94例单原发CRC (SPCRC)患者也进行了基于ngs的分子检测。对13 276例CRC患者进行了病理检查和免疫组化。在该队列中，922例患者患有MMR (dMMR)缺陷CRC。当前研究中的患者入组情况见图2．
根据各病灶的IHC结果，将239例sMPCC患者的MMR状态分为精通MMR组(189例[79.1%])、dMMR组(40例[16.7%])和dMMR + pMMR组(10例[4.2%])。根据各病灶的基因组测序结果，将78例sMPCC患者的MSI状态分为MSS组(61例[78.2%])、MSI- h组(10例[12.8%])和MSI- h + MSS组(7例[9%])。MMR状态与MSI状态高度一致(75例[96.2%])(表1)补充1）.
包含在单个患者数据的汇总分析中的临床试验样本的概述表1．在纳入汇总分析的239例sMPCC患者中，3组之间在入组时的年龄作为连续变量被检测到显著差异，但没有作为分类变量。在性别、临床分期、病变数量、治疗方法或组织学类型上均无差异。
我们回顾性分析了同期在我中心接受手术治疗的SPCRC患者的资料，并检测了他们的MMR状况。sMPCC患者dMMR的发生率明显高于SPCRC患者(239例患者中50例vs 13 037例患者中872例)。NGS检测MSI状态的结果与MMR检测结果一致，78例患者中有17例发生MSI, 94例患者中有5例发生MSI (表2）.
在189例接受NGS的患者中(78例sMPCC患者中158个肿瘤，111例SPCRC患者中111个肿瘤)，我们发现sMPCC患者中富集最多的基因变异类型是C>T (G>A)(图2)补充1)，最常见的变异基因是APC(158个肿瘤中有103个[65%])，喀斯特(158个肿瘤中的78个[46%])，TP53(158个肿瘤中的49个[31%])，PIK3CA(158个肿瘤中的39个[25%])，以及表皮生长因子受体(158个肿瘤中的36个[23%])，而SPCRC患者中最常见的变异基因为APC(111例肿瘤中有79例[71%])，TP53(111例肿瘤中71例[64%])，喀斯特(111例肿瘤中44例[40%])，FBXW7(111例肿瘤中有22例[20%])，以及PIK3CA(111例肿瘤中14例[13%])。我们还发现变异基因在三个亚组之间存在显著差异。MSI-H组的前5个变异基因分别为APC(22例肿瘤中15例[68%])，FAT4(22例肿瘤中14例[64%])，TCF7L2(22个肿瘤中有13个[59%])，KMT2B22个肿瘤中的12个[55%])，以及ARID1A(22例肿瘤中10例[45%]);而MSI-H组和MSS组则为APC(14例肿瘤中有8例[57%])，KMT2B(14例肿瘤中有6例[43%])，KMT2C(14例肿瘤中有6例[43%])，自动取款机(14例患者中6例[43%])，以及PRKDC(14例肿瘤中6例[43%]);而MSS组是APC(122个肿瘤中的80个[66%])，喀斯特(122例肿瘤中有60例[49%])，TP53(122例肿瘤中44例[36%])，PIK3CA(122例肿瘤中有26例[21%])，以及表皮生长因子受体(122个肿瘤中的25个[20%]补充1）.
每组sMPCC和SPCRC患者各病灶的富集通路如图3B所示补充1．我们评估了10个具有频繁基因改变的典型信号通路，从TCGA之前出版物中探索的这些通路中的关键癌症基因开始，并关注可能是功能贡献者或治疗靶点的通路成员。万博ManBetX网页分析的通路为(1)细胞周期，(2)Hippo信号通路，(3)Myc信号通路，(4)Notch信号通路，(5)氧化应激反应/NRF2， (6) PI-3-Kinase信号通路，(7)受体酪氨酸激酶(RTK)/RAS/MAP-kinase信号通路，(8)TGFβ信号通路，(9)P53信号通路，(10)β-catenin/Wnt信号通路。18对于每一组，我们计算了10个信号通路中每一个至少有1个改变的样本的比例。还提供了每组改变的基因组片段。RTK-RAS通路是所有4组中改变频率最高的信号通路。其他9条最常改变基因的高改变频率信号通路在4组间略有差异，但无明显差异。
在测序检测到的78例sMPCC患者中，15例(19.2%)存在致病或可能致病种系变异(PGVs)， 11例(13.75%)存在SPCRC。pgv患者在sMPCC组和SPCRC组之间具有可比性(表2)补充1）.此外，分析了pgv与患者家族史之间的关系，并列在表3中补充1．PGVs组中有家族史的患者比例(15例患者中有7例[46.7%])明显高于无PGVs组(63例患者中有3例[4.8%])。
189例患者的TMB数据可用。78例sMPCC患者中，MSI-H组10例患者的中位(IQR) TMB值为55.6(44.7-68.3)个突变/兆酶，MSI-H组和MSS组7例患者的中位(39.9(27.0-87.8)个突变/兆酶，MSS组61例患者的中位(4.2(3.3-5.6)个突变/兆酶。根据TMB值(截断值=每兆酶10个突变)，MSI-H亚组(10例患者中有10例[100%])，MSI-H和MSS亚组中有7例(85.7%)TMB- h, MSS亚组中有61例(8.2%)TMB- h (图3）.然而，在111例SPCRC患者中，中位数(IQR) TMB为每兆酶4.2(2.3-5.4)个突变，这与sMPC中所有MSS的亚组相似。sMPCC和SPCRC中所有MSS亚组之间TMB-H患者无显著差异(61例患者中5例vs 111例患者中11例)。与SPCRC患者相比，sMPCC患者较高的TMB与较高的MSI相关(表4)补充1）.
dMMR患者的中位OS为95.7个月，而所有pMMR患者的中位OS为103.7个月(风险比[HR]， 0.995;95% ci, 0.454-2.180;P= 0)。同样，dMMR患者的中位PFS为95.2个月，而所有pMMR患者的中位PFS为103.3个月(HR, 0.62;95% ci, 0.35-1.11;P= 16)。虽然两组患者MMR状态OS、PFS差异无统计学意义，但OS、PFS变化趋势有明显差异。MSI状态也有类似的趋势。在肿瘤均为MSI-H/MSI-H和MSS的患者中，OS为95.7个月，而所有MSS患者的OS为58.0个月(HR, 0.44;95% CI, 0.17-1.16个月;P= .17)(图4在补充1）.
由于sMPCC在一般人群中发病率相对较低，sMPCC的致病变异仍不清楚。同一患者中不同恶性病变的发展是否与相同的体细胞或生殖系突变有关，需要评估。在过去的十年中，PD-1阻断等免疫疗法在治疗多种肿瘤方面取得了重大进展。19大约12%的CRC患者有散发的MSI/dMMR。20.PD-1阻断已被证明在dMMR/MSI-H CRC中引起良好的反应，并已被推荐作为转移性dMMR/MSI-H CRC的一线治疗。21MMR/MSI状态在CRC的治疗中发挥着越来越重要的作用;然而，同一例sMPCC患者不同病变的MMR/MSI状态是否一致尚不清楚。因此，在这项队列研究中，我们评估了在过去十年中治疗的13 276例CRC患者中239例sMPCC患者的MMR/MSI状态。正如预期的那样，IHC和NGS证实，sMPCC中dMMR/MSI-H的发生率明显高于SPCRC(表1)补充1）.基于这些发现，我们得出结论，与SPCRC患者相比，sMPCC患者可能从免疫治疗中获得更高的潜在益处。
据我们所知，sMPCC的分子分型此前未见报道，本研究首次对所有sMPCC患者的每个病变进行评估，也是迄今为止sMPCC病例数量最多的研究。有趣的是，我们发现不同sMPCC病变的MMR/MSI状态并不完全一致。一些sMPCC患者可能同时存在dMMR/MSI-H和pMMR/MSS病变。因此，我们根据MMR/MSI状态将sMPCC分为3个亚组:所有dMMR/MSI- h、dMMR/MSI- h和pMMR/MSS，以及所有pMMR/MSS组。所有pMMR/MSS组的发生率在3个亚组中最高，这与SPCRC中pMMR/MSS状态的发生率一致。但sMPCC组dMMR/MSI-H发生率明显高于SPCRC组。
虽然在pMMR/MSS组和其他2个亚组之间OS和PFS没有显著差异，但dMMR/MSI-H状态的sMPCC患者往往比pMMR/MSS组有更好的生存，这是因为除我们报道的单个病例外，本队列中的sMPCC患者没有接受免疫治疗。在CRC免疫治疗的背景下22-26以及该病例的治疗效果，我们认为分子分型指导治疗对sMPCC患者是必要的。对于所有dMMR/MSI-H亚组，可以优先考虑PD-1阻断等免疫治疗。对于dMMR/MSI-H和pMMR/MSS亚组，可能推荐PD-1阻断联合化疗。新辅助化疗加或不加靶向治疗可能适用于所有pMMR/MSS亚组。由于sMPCC个体病变的不同变异以及分子分型指导治疗的必要性，我们建议在新诊断的sMPCC患者中检测每个病变的MMR/MSI状态是必要的。
基因组分析显示，sMPCC患者中富集最多的基因变异类型为C>T (G>A)。发病率TP53sMPCC的变异显著低于SPCRC (31% vs 64%)。同时，其他最常见的变异基因的发生率，包括PIK3CA，表皮生长因子受体，ARID1A，NF1，SOX9，FAT4,TCF7L2，均高于SPCRC组。此外，我们发现sMPCC患者的TMB比SPCRC患者的MSI更高。此外，我们还发现3个亚群之间存在变异基因差异。前5个变异基因分别是APC，FAT4，TCF7L2，KMT2B,ARID1AMSI-H组;APC，KMT2B，KMT2C，自动取款机,PRKDCMSI-H组;和APC，喀斯特，TP53，PIK3CA,表皮生长因子受体在MSS组。最后，尽管我们发现sMPCC和SPCRC之间具有致病性或可能的pgv的患者具有可比性，但具有家族史的sMPCC患者更有可能携带pgv。此外，与SPCRC相比，sMPCC不同亚型之间通路富集无显著性差异。
本研究的局限性包括但不限于缺乏采用分子分型指导治疗的sMPCC病例。需要更大规模的研究和长期随访来进一步证实分子分型指导治疗sMPCC患者，并将这种个体策略导致的病理反应与PFS和OS联系起来。前瞻性试验是必要的，以确定分子分型联合个体化治疗在治疗和减少sMPCC患者复发中的作用。
我们的结果显示，sMPCC患者dMMR/MSI-H的发生率明显高于SPCRC患者。我们建议在治疗前验证sMPCC患者各病变的MMR/MSI状态，并将这些患者根据MMR/MSI状态分为3个亚组。我们的研究结果表明，具有不同MMR/MSI状态的sMPCC患者可以接受个性化治疗，以更好地管理疾病。
接受出版:2022年10月11日。
发表:2022年11月23日。doi:10.1001 / jamanetworkopen.2022.43457
开放:这是一篇开放获取的文章，根据CC-BY许可证．©2022赵颖等。狗万体育下载地址JAMA网络开放．
相应的作者:范欣娟，医学博士，中山大学附属第六医院病理科，广州元村二横路26号，510655 (fanxjuan@mail.sysu.edu.cn）;黄俊，医学博士，中山大学附属第六医院结直肠外科，广州元村二横路26号，510655 (huangj97@mail.sysu.edu.cn）.
作者的贡献:dr . Y. Zhao和dr . Huang可以完全访问研究中的所有数据，并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。dr . Zhao, Wu, Pei和Y. Zhang对这项研究做出了同样的贡献。
概念及设计:王敏，黄敏，范俊杰。
数据的获取、分析或解释:赵玉玉，吴，裴培，张玉玉，白，石，张欣，马俊杰，赵欣，马涛，黄俊杰。
文稿起草:赵玉云，吴培，白，张晓霞，马建军。
对重要知识内容的手稿的批判性修订:张玉玉，史晓霞，马涛，王明，黄敏，范俊杰。
统计分析:y赵,吴,裴,史,j .马迷。
获得资助:j .黄。
支持:行政、技术或物质上的支持:白，赵x，黄敏，范。
监督:王，黄敏，黄杰。
利益冲突披露:没有报道。
资金/支持:国家自然科学基金项目(No. 81972885)、中山大学附属第六医院1010项目(1010CG[2020]-20)、国家临床重点学科资助。
资助者/发起人的角色:资助者在研究的设计和实施中没有任何作用;数据的收集、管理、分析和解释;手稿的准备、审查或批准;并决定将手稿提交出版。
会议介绍:这项研究的摘要在2022年美国临床肿瘤学会年会上的海报会议上发表;芝加哥,伊利诺斯州;2022年6月5日。
数据共享声明:看到补充2．