三联疗法治疗肌肉浸润性膀胱癌成人患者MRE11与死亡率的分析

要点

问题膀胱癌中DNA修复蛋白MRE11水平是否与肌肉侵袭性膀胱癌患者保膀胱三模态治疗后的预后相关?

发现在这项预后研究中，来自6个肌肉侵袭性膀胱癌三联疗法前瞻性临床试验的患者，较高的规范化MRE11蛋白表达与显著降低的疾病特异性死亡率相关。

意义这些结果表明，肌肉侵袭性膀胱癌患者在三模态治疗后，较高的规范化MRE11水平与更好的预后相关，而较低的MRE11可能表明预后不良的亚组可能受益于强化治疗。

重要性保膀胱三联疗法可能是根治性膀胱切除术治疗肌肉侵袭性膀胱癌(MIBC)的有效替代方案，但需要生物标志物来指导最佳患者选择。DNA修复蛋白MRE11是一种候选应答生物标志物，尚未在前瞻性队列中使用标准化测量方法进行验证。

客观的利用自动定量图像分析评估MRE11在接受三模态治疗的MIBC患者中作为预后生物标志物的表达。

设计、设置和参与者这项预后研究分析了来自1988年至2007年北美37个参与机构的6项前瞻性三联疗法I/II、II或III期试验(放射治疗肿瘤组[RTOG] 8802、8903、9506、9706、9906和0233)的MIBC患者。符合条件的患者均为非转移性MIBC，并参加了6项三模态治疗临床试验中的1项。分析于2020年8月完成。

曝光经尿道膀胱肿瘤切除术和顺铂为主的放化疗三模态治疗。

主要成果及措施MRE11表达与疾病特异性(膀胱癌)死亡率(DSM)的关系，定义为膀胱癌死亡。用抗MRE11抗体对预处理的肿瘤组织进行免疫荧光处理，并使用自动定量图像分析计算基于核-胞浆(NC)信号比的MRE11归一化评分。

结果6项试验的465例患者中，168例患者有可用组织，其中135例可分析MRE11表达(中位年龄为65岁[最小-最大，34-90岁];111名(82.2%)男性)。存活患者的中位(最小-最大)随访时间为5.0(0.6-11.7)年。中位数(Q1-Q3) MRE11 NC信号比为2.41(1.49-3.34)。MRE11 NC比值高于1.49(即高于第一四分位数)的患者的DSM明显较低(HR, 0.50;95% ci, 0.26-0.93;P= 03)。MRE11 NC信号比为1.49或更低的患者4年DSM为41.0% (95% CI, 23.2%-58.0%)，高于1.49的患者为21.0% (95% CI, 13.4%-29.8%)。MRE11 NC信号比与总生存期无显著相关性(HR, 0.84;95% ci, 0.49-1.44)。

结论与相关性在三模态治疗后，MRE11 NC信号比更高与更好的DSM相关。较低的MRE11 NC信号比值表明预后较差的亚组可能受益于强化治疗。

虽然肌肉侵袭性膀胱癌(MIBC)通常采用根治性膀胱切除术治疗，但保留膀胱的三联疗法包括最大经尿道膀胱肿瘤切除术(TURBT)，然后放化疗可能是一种有效的替代方法。^1，2多项研究表明，在选定的患者中，三模态治疗与根治性膀胱切除术具有相似的长期结果^3.-7同时避免围手术期的并发症，保持患者的生活质量。⁸临床选择三联疗法最佳候选者的标准包括T2期疾病和无肾积水或原位癌，但这些都是不完善的选择因素。⁹对于预后和预测性生物标志物的需求尚未得到满足，以精确指导适合三模态治疗的患者的最佳选择。¹⁰

MRE11是一种DNA核酸酶，在协调对DNA损伤的反应中起着重要作用，包括双链DNA断裂和复制分叉停滞。¹¹MRE11已被确定为一种候选预测生物标志物，其中较高的水平与较高的辐射敏感性相关，可能是由于徒劳地试图抵消DNA修复中固有的细胞缺陷。¹⁰一项使用免疫组化的回顾性研究显示，MRE11水平高(高于最低四分位数)与MIBC放疗后更好的癌症特异性生存率相关，但与根治性膀胱切除术后无关。¹²这些发现在一项单独的回顾性研究中得到了支持，该研究对接受膀胱保留疗法的患者进行了研究，其中83%的患者同时接受了化疗。¹³然而，对英国两项前瞻性膀胱保存治疗试验的分析并没有成功地验证MRE11作为放射反应的生物标志物。¹⁴值得注意的是，尽管采用了标准的免疫组化染色和解释操作程序，但本研究中MRE11水平的变动性高，中心间评分一致性差，这可能限制了识别MRE11与结果之间显著相关性的能力。¹⁴

自动定量图像分析(AQUA)是一种数字免疫荧光技术，可重复量化蛋白质表达，克服了手工免疫组化的许多方法学限制。¹⁵在本研究中，采用标准化的符合clia条件的AQUA测定法，评估纳入6项前瞻性放射治疗肿瘤组(RTOG)临床试验(NRG/RTOG no . 8802、9506、9706、9906、0233、8903)的MIBC患者的规范化MRE11表达作为三模态治疗应答的生物标志物。^4，16-21

纳入分析的患者均为非转移性MIBC，纳入了6项前瞻性RTOG三联疗法临床试验中的1项(NRG/RTOG no . 8802、9506、9706、9906、0233、8903)，肿瘤组织可分析MRE11表达和核-细胞质(NC)信号比(图1)．对于每个RTOG临床试验，都获得了书面知情同意，包括对肿瘤组织的分析。该研究已获得莫菲特癌症中心机构审查委员会的批准。本研究遵循了大部分关于个体预后或诊断的多变量预测模型的透明报告(三脚架)的预后研究报告指南，尽管它的目的不是为个人建立一个完整的预测模型。患者纳入和排除标准、特征、接受的治疗方法和临床结果在报告每次试验的出版物中进行了描述，万博ManBetX网页^16-21并简要总结如下:

这项II期试验从1988年到1990年在21个机构招募了90例可分析的非转移性MIBC患者，他们接受了2个周期的新辅助甲氨蝶呤/顺铂/长春碱(MCV)，然后每天一次放射治疗至39.6格雷(Gy)，同时顺铂(70 mg/m)²每3周)。放射治疗包括小型盆腔4场技术，包括整个膀胱、膀胱肿瘤、前列腺(男性)和邻近的盆腔淋巴结。

这项III期试验从1990年到1993年在37个机构随机分配123例可分析的非转移性MIBC患者，分别接受2个周期的新辅助MCV和无MCV，随后每天一次39.6 Gy的盆腔放疗和2个周期的同时使用顺铂(100mg /m)²每3周)。39.6 Gy放射治疗后再活检完全缓解的患者接受巩固治疗，25.2 Gy放射治疗(总剂量，64.8 Gy)和1个额外的顺铂周期。

这项I/II期试验从1995年到1997年在11个机构招募了34名可分析的非转移性MIBC患者。TURBT后，患者接受诱导加速低分馏(每分馏3 Gy)每日两次向骨盆(24 Gy)进行RT，同时使用顺铂(15 mg/m)²第1至3天和第15至17天)和氟尿嘧啶(400 mg/m)²第1 - 3天和第15 - 17天)。完全缓解的患者接受全膀胱和膀胱肿瘤(总剂量，膀胱和肿瘤44 Gy，盆腔淋巴结24 Gy)每日两次放射治疗(2.5 Gy /份)，同时使用氟尿嘧啶和顺铂。

这项I/II期研究从1997年到1999年在16个机构招募了47名可分析的非转移性MIBC患者。TURBT治疗后，患者接受诱导放疗，每天两次，上午向骨盆照射1.8 Gy，下午向膀胱肿瘤照射1.6 Gy，持续13天(膀胱肿瘤40.8 Gy，骨盆21.6 Gy)，同时每周顺铂(20 mg/m)²每周前两天)。放射治疗41.6 Gy后再活检完全缓解的患者接受每周顺铂治疗，每天两次(每个部位1.5 Gy)，持续8天(总剂量，骨盆和膀胱45.6 Gy，膀胱肿瘤64.8 Gy)。

这项I/II期试验从1999年到2002年在21个机构招募了78名可分析的非转移性MIBC患者。TURBT治疗后，患者在13天内每天进行两次诱导加速放疗，包括上午向骨盆注射1.6 Gy，前5天向膀胱注射1.5 Gy (7.5 Gy)，然后下午向肿瘤注射1.5 Gy (12.0 Gy)(总剂量，骨盆20.8 Gy，全膀胱28.3 Gy，膀胱肿瘤40.3 Gy)，同时每周顺铂(20 mg/m)²每周2天)和紫杉醇(50毫克/米²每周)。40.3 Gy放射治疗后再活检完全缓解的患者接受1.5 Gy每日两次盆腔放射治疗，剂量为24 Gy(总剂量，膀胱肿瘤64.3 Gy，骨盆44.8 Gy)，同时每周顺铂和紫杉醇。患者接受4个周期的辅助顺铂(70 mg/m²)和吉西他滨(1000 mg/m²)．

这项II期随机试验从2003年到2007年在24个机构招募了93例可分析的非转移性MIBC患者。TURBT后，患者接受每日两次放射治疗，如RTOG 9906，并随机分配同时紫杉醇(50 mg/m)²每周)加上顺铂(15mg /m)²每周3天)或氟尿嘧啶(400毫克/米)²每隔一周2天)在诱导和巩固阶段加顺铂，然后辅助吉西他滨，紫杉醇和顺铂。

从每个预处理肿瘤组织块上切下4 μm厚的切片，用二甲苯脱蜡，用乙醇漂洗，再水化。在121°C的柠檬酸盐缓冲液(Dako)中进行热诱导的表位检索，在隐形室(Biocare Medical)中进行6分钟。玻片用自动染色仪(Dako)染色。内源性过氧化物酶活性用过氧化物酶阻滞抑制5分钟(Dako)。用三缓冲盐水Tween-20洗涤缓冲液(Dako)清洗载片，然后与含有1:1500稀释的MRE11兔单克隆抗体克隆EPR3471 (Epitomics)和泛细胞角蛋白小鼠单克隆抗体(Dako)的信号染色蛋白块(Cell Signaling)在室温下孵育30分钟。MRE11信号用山葵过氧化物酶偶联山羊抗兔抗体和cyanine 5荧光基团标记的tyramide信号扩增试剂(Akoya Biosciences)进行扩增和可视化。使用山羊抗小鼠Alexa Fluor 555二抗(Invitrogen)观察泛细胞角蛋白。染色细胞用DAPI(4'， 6-二胺-2'-苯基吲哚二盐酸盐)(Vector Laboratories, Inc)置入培养基中。所有工作都在临床实验室改进修订(CLIA)级实验室进行，由CLIA合格人员在莫菲特癌症中心的病理组织核心设施进行。

用Aperio FL扫描仪对染色和安装的载玻片进行数字扫描，并用AQUA软件对捕获的图像进行分析。¹⁵利用DAPI信号定义核掩膜，细胞角蛋白信号识别上皮区，对图像文件中的细胞隔室进行数字映射。肿瘤掩膜定义为细胞角蛋白信号加核信号。肿瘤核掩膜定义为细胞角蛋白阳性区域内的DAPI信号。使用这些掩模，MRE11信号可以在肿瘤核和肿瘤细胞质内测量。每个亚细胞隔间内的AQUA评分通过将信号强度除以指定隔间的总面积来计算。^15，22，23计算核-细胞质(NC) MRE11 AQUA评分的比值，并将其作为标准化MRE11评分。

临床完全缓解定义为麻醉下两手检查未见肿瘤，膀胱镜未见肿瘤，肿瘤部位活检阴性，临床方案定义的尿细胞学阴性。保留膀胱患者主动监测，第一年每3个月进行膀胱镜检查、肿瘤部位活检、麻醉下两手检查、尿液细胞学检查，第二年每3 ~ 4个月进行膀胱镜和细胞学检查，3年每6个月进行一次，之后每年进行一次。非肌肉浸润性局部失败的患者考虑膀胱内治疗，肌肉浸润性局部失败的患者接受挽救性根治性膀胱切除术。所有数据在NRG/RTOG统计和数据管理中心集中收集。

所有终点的测量从研究开始之日(II期研究)或随机分配(III期研究)到首次记录事件之日。对于总生存期(OS)和疾病特异性死亡率(DSM)，分别测量了因膀胱癌死亡或因膀胱癌死亡的时间。对于膀胱完整的总生存期(BIOS)，失败时间测量为膀胱切除术第一次发生日期或因任何原因死亡日期。没有给定终点事件的患者在最后一次随访时被删除。

MRE11 NC比率作为分类变量进行分析，使用较低的四分位数(Q1或低于Q1 vs高于Q1)作为切点。使用χ进行统计比较，以评估基线特征和完全缓解与MRE11 NC比值类别之间的潜在关联²或费雪精确检验。此外，还比较了有MRE11 NC比值数据的患者与无MRE11 NC比值数据的患者的基线特征。

Kaplan-Meier法²⁴用于估计OS和BIOS, log-rank测试²⁵用于比较MRE11表达组。累积发病率²⁶用于估计DSM, Gray检验²⁷用于比较MRE11表达组。除膀胱癌以外的任何原因导致的死亡被认为是DSM的竞争风险。Cox比例风险回归模型²⁸用于获取OS和BIOS的风险比(HRs)。Fine-Gray回归²⁹用于DSM的HRs。在多变量分析中，在MRE11 NC中评估了以下变量:年龄(70岁以下vs 70岁或以上)、性别(男性vs女性)、种族(白人vs其他)、东部肿瘤合作组(ECOG)的表现状态(0 vs 1)、T分期(T2 vs T3/T4)、经尿道膀胱肿瘤切除术(TURBT)(是vs否或未知)。种族被归类为“白人vs其他”，因为其他种族和民族的样本量非常小(亚洲患者除外)。所有分析均使用SAS 9.4版本(SAS Institute)进行。显著性阈值为P<。在双侧测试中为05。分析于2020年8月完成。

在6个前瞻性RTOG三联疗法临床试验中纳入的465例非转移性MIBC患者中，168例患者的肿瘤组织可分析MRE11表达，其中135例(80.4%)可分析MRE11 NC比率(表1)．135例可分析患者中，111例(82.2%)为男性，中位年龄为65岁(最小-最大，34-90岁)。除了没有可分析组织的患者更有可能是White(330例中有268例[81.2%]，135例中有87例[64.4%])外，大多数特征在两组之间没有显著差异;P< .001)，患有T3或T4疾病(330 / 148 [44.8%]vs 135 / 36 [26.7%];P<措施)。

来自NRG/RTOG临床试验的肿瘤标本跨越多年，容易受到免疫荧光信号绝对强度变化的许多可能来源的影响，包括样本年龄、缺血、固定类型、固定时间、切割切片和染色之间的时间、存储条件和其他分析前组织处理变量。^23，30.为了校正变异和批处理效应，MRE11信号强度通过计算NC MRE11信号比归一化。原因是这些分析前变量可能导致MRE11信号在细胞核和细胞质中衰减的速率相似。因此，NC比率应该在广泛的条件下能够抵抗变化。当该方法应用于MIBC样本时，发现MRE11 NC比率在较老和较新病例之间没有显著差异(图2)补充)．因此，通过NC比值对MRE11信号进行归一化，可最大限度地减少因分析前变量引起的抗原降解所产生的批效应。

可分析病例的MRE11 NC比率中位数为2.41(第一四分位数为1.49;第三四分位数，3.34)，平均值为2.52 (min-max, 0.69-6.03)补充)．存活患者的中位(最小-最大)随访时间为5.0(0.6-11.8)年。值得注意的是，MRE11 NC比值高于二进制切点1.49(由第一四分位数阈值定义)的患者与MRE11 NC比值较低的患者相比，DSM显著降低。MRE11 NC比率为1.49或以下的4年累积发病率为41.0% (95% CI, 23.2%-58.0%)，而比率高于1.49的4年累积发病率为21.0% (95% CI, 13.4%-29.8%) (HR, 0.50;95% ci, 0.26-0.93;P= .03) (表2而且图2)．OS、BIOS或完全应答的MRE11 NC比率没有显著差异(表2)．在DSM的多变量回归模型中，在调整了其他协变量后，MRE11 NC比高于1.49与比1.49或更低相比，DSM下降58% (HR, 0.42;95% ci, 0.22-0.81;P= .009) (表3)．模型中的其他重要协变量包括ECOG性能状态(1 vs 0: HR, 2.69;95% ci, 1.05-6.88;P= .04)和种族(其他vs白人:HR, 0.39;95% ci, 0.16-0.94;P= .04点)。模型中的变量之间没有相关性。总之，这些数据表明膀胱肿瘤中较高的标准化MRE11 NC比率与膀胱保留三模态治疗后较低的DSM相关。

保膀胱三联疗法是越来越多接受的MIBC治疗方案^1，2这避免了根治性膀胱切除术的围手术期发病率和生活质量的降低。⁸虽然临床病理因素已被确定与三模态治疗后的结果相关，⁹这些可能不足以作为选择标准，需要可靠的生物标志物来选择合适的患者。为了评估DNA修复蛋白MRE11作为预后生物标志物，一种符合clia标准的AQUA¹⁵该方法定量测量了6个前瞻性NRG/RTOG三模态治疗临床试验患者预处理肿瘤组织中规范化MRE11的表达。高于二进制切割点1.49的高MRE11 NC信号比与4年DSM为21%相关，而MRE11水平较低的患者为41%。在调整临床协变量(包括肿瘤分期)后，在多变量回归模型中，高MRE11 NC比值与低DSM之间的相关性仍然显著。在该模型中，较低的ECOG表现状态和非白种人也与较低的DSM相关，尽管这些发现需要在其他队列中验证。

膀胱保存治疗的几种候选生物标志物已被确定，涉及DNA修复、信号转导、增殖、血管生成和免疫反应。¹⁰MRE11的高表达与MIBC放疗后的预后改善有关，^12，13但转化为临床应用一直具有挑战性。先前的研究使用专有的研究级免疫组化方法，并基于研究人群而不是绝对表达定义了二元切点，因此限制了在CLIA实验室的标准化实施。^12，13目前的研究开发了一种标准化的符合clia条件的免疫荧光检测方法，通过AQUA定量MRE11 NC信号比来测量福尔马林固定石蜡包包组织中标准化MRE11的表达。¹⁵与免疫组化不同，免疫荧光具有较高的灵敏度和较大的动态范围，能够精确测量和同时定位多个蛋白质。使用内部标准(核信号与细胞质信号的比较)进行标准化，可以建立自动化的分析方法，克服批处理效应、分析前变量和人为误差带来的偏差。这种归一化策略是基于MRE11的强核定位和可能的细胞质信号背景性质，^31，32尽管我们不能排除MRE11 NC比例可能与MRE11整体表达具有不同的生物学意义的可能性。使用这一符合clia标准的试验，在前瞻性临床试验标本中发现MRE11 NC比率与三模态治疗后更好的DSM相关。

膀胱肿瘤中较高水平的MRE11与放化疗后更好的结果相关，这一发现与先前的研究一致。^12，13尽管DNA修复蛋白的高表达可能与抗辐射诱导的DNA损伤有关，但在其他情况下也注意到与对DNA损伤更敏感的观察到的关联。在乳腺癌中，由于4个DNA修复基因的高表达而导致的较低的重组熟练度评分预示着对DNA损伤化疗的较高敏感性。³³一种解释是，较高水平的DNA修复基因可能反映了肿瘤细胞对抗DNA修复中固有的细胞缺陷的徒劳尝试，这种缺陷使它们对辐射更敏感。也有新兴数据表明MRE11活性与cGAS-STING通路激活之间存在联系，这表明较高的MRE11水平可能与先天免疫反应的增加有关。³⁴相比之下，较低水平的MRE11确定了三模态治疗导致相对较高DSM的亚组。这种预后差的亚组可能更适合根治性膀胱切除术治疗，或者可能受益于通过在三联疗法中增加免疫检查点抑制剂或靶向治疗来加强治疗。

这项研究有几个局限性。NRG/RTOG合并队列中的许多病例没有可分析的组织，部分原因是这些历史试验的标本的年龄和先前的使用。需要进一步优化AQUA方法以减少损耗并达到商业可扩展性。尽管如此，该研究充分证明了利用现有组织检测MRE11的显著预后价值。这项研究并不是为了确定MRE11是否是一种预测性生物标志物，这与之前的研究不同。^12，13此外，其他潜在的放化疗反应生物标志物的贡献，如免疫浸润，没有被检查。³⁵在未来的三模态治疗研究中，评估MRE11与其他生物标志物(包括其他DNA修复基因改变)的联合将是重要的。

总之，在NRG/RTOG膀胱保存试验中，MIBC患者中规范化的MRE11表达与三模态治疗后的结局相关。较高的MRE11 NC比值(即，使用符合clia标准的AQUA测定时高于1.49)与较低的DSM相关。SWOG/NRG 1806试验的前瞻性验证(NCT03775265)和其他研究可以证明MRE11和其他生物标志物可用于精确选择患者进行三模态治疗，并用于识别可能受益于强化治疗的预后不良患者。

接受出版:2022年9月20日。

发表:2022年11月16日。doi:10.1001 / jamanetworkopen.2022.42378

开放:这是一篇开放获取的文章，根据CC-BY许可证．©2022 Magliocco AM等。狗万体育下载地址JAMA网络开放．

通讯作者:David T. Miyamoto，医学博士，放射肿瘤科，马萨诸塞州总医院，149 13街，4406/4427A室，查尔斯敦，MA 02129 (dmiyamoto@mgh.harvard.edu)．

作者的贡献:Magliocco博士和Miyamoto博士可以完全访问研究中的所有数据，并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。Magliocco博士和宫本茂博士是共同第一作者;冯博士和Efstathiou博士是共同资深作者。

概念及设计:Magliocco，宫本茂，Simko, Shipley, Gray, Tester, Winter, Efstathiou。

数据的获取、分析或解释:Magliocco, Moughan, Miyamoto, Simko, Hagan, Parliament, Zietman, McCarthy, Saeed-Vafa, Xiong, Ayral, Hartford, Patel, Rosenthal, Chafe, Greenberg, Schwartz, Augspurger, Keech, Winter, Feng, Efstathiou。

文稿起草:Magliocco, Miyamoto, Xiong, Winter, Efstathiou。

对重要知识内容的手稿的批判性修订:Magliocco, Moughan, Miyamoto, Simko, Shipley, Gray, Hagan, Parliament, Tester, Zietman, McCarthy, Saeed-Vafa, Ayral, Hartford, Patel, Rosenthal, Chafe, Greenberg, Schwartz, Augspurger, Keech, Winter, Feng, Efstathiou。

统计分析:Magliocco, Moughan, Xiong, Winter。

获得资助:Magliocco。

支持:行政、技术或物质上的支持:Magliocco, Moughan, Miyamoto, Simko, Hagan, Tester, McCarthy, Saeed-Vafa, Ayral, Rosenthal, Greenberg, Schwartz。

监督:Magliocco, Simko, Shipley, Parliament, Zietman, Rosenthal, Chafe, Schwartz, Augspurger, Winter, Efstathiou。

利益冲突披露:Magliocco博士报告说，在进行这项研究期间，他获得了来自放射治疗肿瘤小组的资助;他报告说，他持有Protean生物诊断公司的所有权股票，从罗氏公司获得资助，并在提交的工作之外从Agena生物科学公司收取个人费用;此外，Magliocco博士还有一项MRE11测量的专利正在申请中。Hagan博士报告说，在进行这项研究期间，他得到了美国退伍军人事务部的非经济支持。Chafe博士报告说，在进行这项研究期间，他从交叉癌症研究所获得了患者累积的资助。冯博士报告说，在提交的工作之外，他还从Janssen、Myovant Sciences、Roivant Pharma、Novartis、Astellas、Foundation Medicine、Exact Sciences收取了咨询费;他报告说，在提交的工作之外，他还为拜耳、SerImmune、Bristol Myers Squibb、蓝星基因组学、Blue Earth Diagnostics和Tempus的科学顾问委员会服务收取个人费用;据报道，他持有股票期权，并担任Artera的顾问;他还报告了共同创立PFS Genomics并持有所有权权益，这一关系于2021年4月结束。Efstathiou博士报告说，在提交的研究之外，他从Blue Earth Diagnostics、Boston Scientific、AstraZeneca、Genentech、Progenics Pharmaceuticals、Merck、Roivant Pharma、Myovant Sciences、Janssen、Bayer Healthcare和Gilead收取了个人费用。 No other disclosures were reported.

资金/支持:该项目由癌症治疗评估计划和NRG肿瘤手术(No. 1)资助。U10CA180868)， NRG肿瘤统计与数据管理中心(No.;U10CA180822)， NCORP(编号:UG1CA189867)、NRG标本库(编号:;U24CA196067)来自美国国立卫生研究院和国家癌症研究所。

资助者/发起人的角色:美国国立卫生研究院参与了对研究设计和实施的审查和批准，以及对手稿的审查和批准以及提交手稿发表的决定。

额外的贡献:我们感谢已故唐纳德考夫曼医学博士对本手稿的贡献。