快速护理点基因分型避免新生儿重症监护中氨基糖苷类诱导的耳毒性

要点

问题快速护理点基因分型技术能否在急性新生儿环境中实施，以避免氨基糖苷诱导的耳毒性，而不破坏正常的护理标准?

发现在这项包括英国751名新生儿的实用前瞻性实施试验中，一个26分钟的快速基因分型平台成功实施，确定了有氨基糖苷诱导耳毒性风险的新生儿，促进了量身定制的处方，并且没有破坏正常的临床实践。

意义快速基因即时检测可用于避免新生儿氨基糖苷类诱导的耳毒性，临床医生能够将基因数据整合到急性环境下的常规实践中。

重要性氨基糖苷类是治疗新生儿败血症的常用抗生素。的MT-RNR1m.1555A>G变异易发生严重氨基糖苷诱导的耳毒性(AIO)。目前的基因分型方法需要几天时间，这在急性情况下是不可行的。

客观的在急性新生儿环境中实施这项技术之前，为m.1555A>G变体开发一种快速护理点测试(POCT)，以指导抗生素处方和避免AIO。

设计、设置和参与者这项务实的前瞻性实施试验招募了2020年1月6日至2020年11月30日期间在英国2个大型新生儿重症监护病房住院的新生儿。

干预措施新生儿入住新生儿重症监护室时通过快速POCT检测m.1555A>G变异。

主要成果及措施主要结局评估成功检测所有处方抗生素婴儿变异的新生儿比例。次要结果衡量实施是否与常规临床实践和系统的性能负相关。这项研究在统计学上得到了支持，以检测在实施抗生素治疗前和实施后抗生素治疗的时间之间的显著差异MT-RNR1过的。

结果共招募了751名新生儿，中位年龄(范围)为2.5(0-198)天。的MT-RNR1POCT能够在26分钟内对m.1555A>G变体进行基因分型。临床前验证显示100%敏感性(95% CI, 93.9%-100.0%)和特异性(95% CI, 98.5%-100.0%)。3名携带m.1555A>G变异的参与者被确定，他们都避免使用氨基糖苷类抗生素。总的来说，424名接受抗生素治疗的婴儿(80.6%)成功检测了该变异，平均使用抗生素的时间与以前的做法相当。

结论与相关性的MT-RNR1在不影响正常临床实践的前提下，整合POCT，并使用基因型指导抗生素处方，避免AIO。这种方法确定了m.1555A>G变体在实践改变的时间框架，广泛采用可以显著减少AIO的负担。

氨基糖苷类抗生素在世界范围内普遍用于治疗革兰氏阴性感染。它们已被证明有效，其安全性也得到了广泛认可。¹在高剂量或长期服用时，氨基糖苷类会引起肾毒性和耳毒性，后者可表现为前庭毒性或耳蜗毒性。²在20世纪后半叶，人们注意到某些家族有氨基糖苷诱导的耳毒性(AIO)的倾向，单次剂量可导致严重和不可逆的听力损失。^3.，4

与这些家族的母系遗传一致，1993年，这种药物不良反应被证明是由于线粒体基因组变异MT-RNR1, m.1555A > G。⁵m.1555A>G变体引起真核生物12S核糖体RNA亚基结构的构象变化，这意味着它更接近于细菌16S核糖体RNA亚基，允许氨基糖苷类结合。这种增强的亲和力对内耳毛细胞的影响最为显著，导致细胞损伤和AIO。^6-8

临床药物遗传学实施联盟和英国药品和保健产品监管局最近发布了关于在m.1555A>G变异个体中使用氨基糖苷类抗生素的指南。^9，10尽管该变异的外显率尚不确定，但其风险已被认为足够高，因此建议携带m.1555A>G变异的个体不应接受氨基糖苷类抗生素，除非永久性听力损失的高风险被感染的严重程度和缺乏安全或有效的替代疗法所抵消。^9，10

静脉注射苄青霉素和氨基糖苷类抗生素庆大霉素是新生儿期感染经验性治疗的首选方案。¹¹在新生儿感染的背景下，有效的替代品存在，如头孢菌素，但其广谱活性促进抗生素耐药生物的发展。因此，氨基糖苷类药物仍然是首选的一线药物，但对于m.1555A>G变异的个体，以头孢菌素为基础的方案是合适的。

由于抗生素应在做出治疗败血症的任何决定后的一小时内交付，目前的遗传技术在临床相关的时间框架内不足以快速检测基因型m.1555A>G。¹²我们开发了m.1555A>G变异的快速基因分型平台，并通过前瞻性实施试验评估了该技术是否可以在不影响新生儿重症监护病房(NICUs)正常临床实践的情况下避免AIO。

该研究得到了国家卫生服务研究伦理委员会(IRAS 253102)和人类研究管理局的批准。国家卫生服务研究伦理委员会和人类研究管理局放弃了对前瞻性同意的要求。MT-RNR1根据英国《2004年人体组织法》，检测被认为是一种例外目的，因此未经前瞻性同意的DNA分析是允许的。这种新的伦理框架，是由正在进行试验的严峻环境所必需的，在其他地方已被广泛讨论。^13-15

鉴于m.1555A>G变异在英国的患病率相对较低，约为0.2%，因此使用传统的前瞻性诊断试验准确性研究来估计护理点试验(POCT)的敏感性将需要一个不可行的大样本量。¹⁶因此，我们将测试分为两个阶段进行评估。首先，该检测方法通过病例对照研究进行临床前验证，然后进行前瞻性试验，以评估在新生儿环境中实施POCT的现实影响。

Genedrive平台是一种快速热循环POCT仪器，可进行环介导等温扩增，然后进行荧光杂交探针熔体分析，以实现等位基因的区分。该方法设计用于从口腔拭子中提取m.1555A>G基因型，通过熔体峰分析区分野生型和变异等位基因(图1)补充1）.

临床前分析特异性通过新生儿、婴儿和成人颊部样本的病例对照临床表现研究进行评估。对来自不同种族的个体样本进行了检测，评估了交叉反应性，并测量了潜在干扰物质的影响。进一步的技术规格载于补充1。

避免听力损失的药物遗传学(PALOH)试验是一项由研究者发起的、实用的前瞻性实施试验(ISRCTN13704894）.¹⁷试验在英国的2个大型新生儿重症监护室进行。这两个中心都符合英国国家临床卓越研究所(NICE)治疗新生儿感染的指导方针。¹¹该指南指出，对于怀疑细菌感染的28日龄以下婴儿，一线抗生素方案应是苄青霉素加庆大霉素。在研究中心，年龄超过28天的婴儿根据当地的抗菌指南开头孢噻肟加庆大霉素(研究地点1)或co-amoxiclav加庆大霉素(研究地点2)。因此，所有在新生儿重症监护室怀疑有细菌感染的婴儿都考虑采用氨基糖苷类治疗方案。试验管理委员会(表4)补充1)及独立督导小组(表5)补充1)的成立是为了监督这项工程。

所有在两个参与地点入住新生儿重症监护室的新生儿都有资格参加。从2020年1月6日至2020年11月30日招募新生儿，并在入院时登记，包括直接从分娩套件入院、从其他病房转来或从外部新生儿病房入院的新生儿。由入院临床医生确定并已建立静脉注射通路的新生儿需要立即使用抗生素，排除在外。的e附录中提供了每个招聘地点的完整的纳入和排除标准列表补充1并且已经出版。¹⁷没有收集有关种族和民族的数据。

在研究期间，入院时进行m.1555A>G颊拭子检查。这些是由入院护士与皮肤拭子同时进行的，这是在两个中心标准执行的，作为常规临床实践的一部分，以筛选耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。¹⁸一旦MT-RNR1如果检测到m.1555A>G变异，则用于指导抗生素处方，避免使用氨基糖苷类抗生素，并开出与现有国家指南一致的替代方案。¹⁹携带m.1555A>G变异的新生儿被转到区域临床遗传学服务中心进行家庭咨询。研究数据由入院护士和研究管理员记录。

主要结果是成功检测m.1555A>G变异的新生儿数量占接受氨基糖苷类抗生素的所有婴儿的比例。次要结果是鉴定出m.1555A>G遗传变异的新生儿总数以及他们是否避免使用氨基糖苷类药物;未进行检测的新生儿比例;拭子的中位时间;以及给抗生素的平均时间。将抗生素给药的平均时间与研究开始前一个月入住NICU的临床时间进行比较。在研究结束时，所有颊部样本都进行了基因分型，以确定该药的真实分析性能MT-RNR1系统。Genedrive的准确性MT-RNR1-ID试剂盒与Sanger测序进行比较。

鉴于变异的低频率，这项研究并没有明确地确保检测到m.1555A>G变异。相反，这项研究的目的是为了检测在实施抗生素治疗前和实施后抗生素治疗的时间之间的显著差异MT-RNR1过的。为了实现零假设统计检验的统计幂为90%，显著性水平为5%，科恩d误差为0.5，假设对照样本为95，在10个月的招聘估计内至少需要54名新兵。

通过描述性统计对主要结果进行分析。对于所有的入院患者，都计算了一个标准化的时间零点，以此来衡量临床时间。在开抗生素的地方，决定开抗生素的时间代表时间0。如果未开抗生素，则时间0以入住NICU的时间表示。

研究前和研究中使用抗生素给药时间的差异，采用平均时间差异的零假设统计检验和双单侧检验进行评估t测试来测试等价性。感兴趣的量是在(μ_c)和在研究期间(μ_t)，并在入院后两小时内接受抗生素治疗。零假设统计检验的零假设是平均时间的差异为零，即H₀μ_c- - - - - -μ_t= 0。两个单侧方程的零假设t测试是这些量之间的差异大于或等于一个科恩d(0.5) margin (Δ)，即H_01:μ_c- - - - - -μ_t≤-Δ;H₀₂:μ_c- - - - - -μ_t≥Δ。

家长和公众代表的参与一直是该试验方案制定的关键组成部分。家长代表均参与试验管理小组、利益相关者委员会(表6)补充1)和一个独立的公众和患者参与和参与小组，提供新生儿护理和/或听力损失经验。公众和患者参与和参与小组参与了方案和伦理应用的开发。主要研究人员和合作研究人员向公众和患者参与和参与小组展示了文本的早期版本，并对任何潜在的争议性问题进行了更详细的讨论。从这些会议中获得的见解用于在提交应用程序之前改进应用程序。

收集159人的颊部样本并进行基因分型(n = 304)，用于临床前检测验证(表1 in补充1）.临床前验证表明，检测灵敏度为100% (95% CI, 93.9%-100.0%)，特异性为100% (95% CI, 98.5%-100.0%)，基因分型时间为26分钟。检测限度，定义为95%以上的测试样本产生阳性结果的最低浓度，为16个细胞。的MT-RNR1在所有被测种族中，可能的干扰物质不影响性能，并且没有交叉反应(e附录，表2和表3)补充1）.进一步的技术规格可在补充1。

共有751名新生儿从2个中心(图1）.大多数新生儿(713名[94.9%])是从一个中心招募的，因为第二个中心的招募暂停了，并且由于SARS-CoV-2爆发而没有重新开始。指导委员会同意，为补偿中心的撤销，招聘将延长一个月。在招募时，参与者的中位年龄(范围)为2.5(0-198)天。分娩时的平均胎龄(SD)为37(4)周。共有526名新生儿(70%)接受了抗生素治疗。在父母的要求下，两名新生儿的数据被从研究中撤回。

总的来说，424名新生儿(80.6%)使用氨基糖苷类抗生素成功检测了m.1555A>G变异。经Sanger测序确认3例新生儿携带m.1555A>G变异。在接受抗生素治疗的526名入院患者中，102名(19.4%)未被成功检测;90项试验(17.1%)失败，12名合格患者(2.3%)未由临床团队进行试验(图1）.在整个队列中，153名(20.4%)入院者未成功检测;128例(17.1%)测试失败，25例(3.3%)入院未由临床团队进行测试。假阳性5例。没有假阴性结果。因此，该方法的真实分析灵敏度为100% (95% CI, 29.2%-100.00%)，特异性为99.2% (95% CI, 98.0%-99.7%)，准确度为99.2% (95% CI, 98.0%-99.7%)。

在整个审判过程中MT-RNR1更新平台以提高效率(返回有效结果的测试比例)和准确性。这一迭代过程确定了假阳性结果的原因，即不完全插入药筒，允许光在熔化阶段进入反应药筒，通过更新药筒设计消除了这一缺陷，以确保药筒的完整组装和插入。不成功的基因分型(测试失败)主要与熔化阶段的低信号强度有关，这一问题在招募后通过对测定缓冲液的修改得到解决(图2)补充1）.与修改后的药筒耗材相结合，重新设计的检测方法显示了减少的失败。对先前基因分型失败的样本的重复检测表明，在预期用途临床环境中进行的失败率提高了5.7%，在实验室中进行的失败率为0%。的e附录提供了更多的细节补充1。

实施前，抗生素治疗的平均(SD)时间为55.87(22.56)分钟，基于95个连续急性入院超过1个月。在研究期间，抗生素治疗的相应平均(SD)时间为55.18(23.82)分钟。前后的实现MT-RNR1试验表明，抗生素治疗的平均时间差异为- 0.87分钟(图2）.

上下两边都是单面t等效性测试是重要的(上:P<措施;低:P< .001)和两个单侧的边界t测试置信区间位于科恩区间内d边缘(95% CI， - 5.96至4.23分钟)。这表明对照和研究样本中使用抗生素的平均时间在统计学上是相等的。原假设统计检验无显著性(97.5% CI， - 6.70 ~ 4.97分钟;P= .74)，这意味着我们未能拒绝零假设，即抗生素的平均时间的真实差异为零。基于两方面的片面t结合检验和零假设统计检验，我们得出结论，在2个样本中观察到的抗生素平均时间差异在统计学上等效于零。在整个研究过程中，棉签的中位时间(IQR)为6(3-16)分钟。在所有鉴定出m.1555A>G基因型的病例中，避免使用氨基糖苷类抗生素，并使用基于头孢菌素的替代方案(图1）.

在这项实用的实施试验中，临床医生能够将一种新的遗传POCT整合到现有的临床途径中，以指导抗生素治疗，避免急性新生儿环境中的AIO。基因分型在大多数新生儿中是成功的，POCT的实施没有对现有的途径产生负面影响，抗生素治疗的时间与以前的做法相当。只有3.3%的入院患者没有接受检测，这表明先前没有基因检测或实验室实践经验的临床团队对该系统的理解非常好。关键是，在鉴定出m.1555A>G基因型的地方，临床医生能够使用该数据进行量身定制的抗生素处方，避免了3名原本接受庆大霉素治疗的婴儿发生AIO。

据我们所知，在这项研究之前，还没有足够快速的基因分型技术可以在新生儿败血症的临床相关时间框架内识别m.1555A>G。英国NICE新生儿感染指南指出，如果新生儿需要抗生素治疗，应在决定治疗后1小时内进行。这符合长期以来的黄金时间概念，这是脓毒症管理中经常被引用的概念。^20.-22在26分钟的运行时间内，临床团队能够在足够短的时间内进行基因分型，这意味着抗生素治疗的平均时间与以前的做法相当。

在临床实践中，已有使用poct鉴定药物遗传变异的先例。先前的研究已经报道了与抗凝血药华法林和抗血小板药氯吡格雷代谢相关的快速基因型变异的努力。^23-25常见的遗传变异会降低这些药物的疗效，及时的基因分型可以为选择替代药物或优化剂量策略提供机会。虽然这些研究和这里描述的研究之间有相似之处，但测试范式MT-RNR1基因型和氨基糖苷类药物治疗带来了更大的压力，以快速和准确的结果。

根据临床情况，利益相关者对可接受的测试性能有自己的阈值。在大多数临床情况下，如果最初的检测失败，可能有足够的时间进行进一步的基因分型。在新生儿败血症中，情况并非如此，在新生儿败血症中，需要在一小时内使用抗生素，延误可能是致命的。¹²在这里，我们发现了实验室和实际检测性能之间的差异，强调了实施试验在评估预期使用环境中实际检测性能的重要性。该试验的设计允许基于研究数据和临床反馈对系统进行迭代改进，从而大大改进了系统的实施。根据我们的经验，这样的实施评估应该成为任何体外诊断制造商开发管道的一部分。

该试验所处的严峻环境带来了一些新的技术、方法和伦理挑战。^13，17据我们所知，这是第一次在急性新生儿环境中实施遗传POCT来指导治疗。临床医生和家长对这种新的基因检测方法的接受程度很高，这从测试的普及和少量的退出就可以证明。

本研究的两个中心都遵循NICE的新生儿感染治疗指南。¹¹当一名婴儿被确定携带m.1555A>G变异时，开始头孢噻肟单药治疗，这是一种被认为具有与苄青霉素加庆大霉素相当的抗菌覆盖率的方案。^26，27因此，这些人接受了同样有效的抗生素，但避免了终身听力损失的可能性。在英国，头孢噻肟不建议作为新生儿感染的一线药物，因为它的广谱活性，如果广泛使用，可能会导致抗菌素耐药性。¹¹整合MT-RNR1将RNR1基因检测纳入新生儿常规实践可能需要制定当地或区域指南，反映当地微生物监测数据，并概述基于RNR1基因型的适当处方。

PALOH试验招募了英国2家大型学术教学医院的患者，这两家医院都有4级新生儿重症监护室，证明了对危重新生儿的急性护理。由于SARS-CoV-2大流行，招聘主要来自单一网站。这两个网站都定期从事研究活动，并在新技术的实施方面拥有丰富的经验。这种经验有助于PALOH试验的交付，但在试图将任何发现推广到其他可能没有同等研究或实施专业知识的中心时，应考虑到这一点。此外，在国家内部和国家之间，抗生素处方做法在处方率和所选择的药物方面显示出相当大的差异。因此，m.1555A>G测试的效用和成本效益将取决于环境。应与来自NICU、微生物学、药学和临床遗传学的利益攸关方一道，将地方价值评估和实施方案作为多学科战略的一部分进行。

这项研究表明，基因分型可以在急性情况下进行，并纳入临床实践，而不破坏现有的护理标准。基于m.1555A>G变异的群体频率，以及全球每年在700多万新生儿中使用氨基糖苷类药物的情况，a . 1555a的采用MT-RNR1POCT有可能每年避免数千例AIO病例，特别是在广泛使用氨基糖苷类药物的低收入和中等收入国家。²⁸在越来越多的急性临床情况下，对个人基因型的了解可用于改善预后，而SARS-CoV-2大流行已导致体外诊断系统激增，可重新部署用于快速基因分型。²⁹该试验展示了一种执行基因分型的技术方法，允许基因分型整合到急性临床路径中，而不破坏正常的护理标准。

接受出版:2021年12月1日。

网上发表:2022年3月21日。doi:10.1001 / jamapediatrics.2022.0187

相应的作者:John H. McDermott，医学博士，MRes (john.mcdermott@mft.nhs.uk)，以及William G. Newman, MD, PhD (william.newman@manchester.ac.uk)，曼彻斯特基因组医学中心，曼彻斯特大学医院NHS基金会信托，曼彻斯特M13 9WL，联合王国。

开放:这是一篇开放获取的文章，根据CC-BY许可证。©2022 McDermott JH等。JAMA儿科。

作者的贡献Newman博士和McDermott博士可以完全访问研究中的所有数据，并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。McDermott博士和Mahaveer博士对这份手稿有同样的贡献。

概念及设计:McDermott, Mahaveer, James, Booth, Harvey, Miele, Corry, Garlick, Ainsworth, Beevers, Bruce, Body, Ulph, Roberts, Wilson, Newman。

数据的获取、分析或解释:McDermott, Mahaveer, James, Turner, Miele, Beaman, Stoddard, Tricker, Ainsworth, Beevers, Body, MacLeod, Wilson, Newman。

文稿起草:McDermott, Mahaveer, James, Miele, Beaman, Stoddard, Ainsworth, Beevers, Roberts, Wilson, Newman。

对重要知识内容的手稿的批判性修订:McDermott, mahaver, James, Booth, Turner, Harvey, Miele, Tricker, Corry, Garlick, Bruce, Body, Ulph, MacLeod, Newman。

统计分析:麦克德莫特，斯托达德，罗伯茨，纽曼。

获得资助:McDermott, Mahaveer, Miele, Beevers, Ulph, Newman。

支持:行政、技术或物质上的支持:McDermott, James, Turner, Harvey, Tricker, Corry, Garlick, Ainsworth, Beevers, Body, MacLeod, Newman。

监督:McDermott, Mahaveer, Turner, Miele, Bruce, Ulph, MacLeod, Wilson, Newman。

利益冲突披露:McDermott博士，James博士和Tricker博士在研究期间报告了国家健康研究所的资助。Miele博士和Beevers博士报告了Genedrive Diagnostics Ltd.颁发的仪器专利。Body博士报告了来自LumiraDx、Abbott Point of Care、Roche、Beckman Coulter、Siemens、Radiometer和Aptamer Group的个人费用;Abbott Point of Care、LumiraDx、西门子和StreamBio的资助;来自Horiba, Randox, iXensor, Menarini, BD和Avacta的非经济支持。没有其他披露的报道。

资金/支持:本报告是由英国国家卫生研究所i4i产品开发奖资助的独立研究:开发和实施即时药物遗传检测以避免新生儿抗生素相关听力损失(II-LB-0417-20002)。曼彻斯特国家健康研究所生物医学研究中心的额外支持，听力健康主题(IS-BRC-1215-20007)。试点数据支持来自听力损失行动。

资助者/发起人的角色:国家听力损失健康研究与行动研究所没有参与这项研究的设计和实施;数据的收集、管理、分析和解释;手稿的准备、审查或批准;并决定将手稿提交出版。

组信息:万博manbetx平台首页PALOH研究小组成员列于补充2。

免责声明:本出版物所表达的观点是作者的观点，不一定是国家卫生服务、国家卫生研究所或卫生和社会保健部的观点。

额外的贡献:我们感谢参与这项试验的新生儿重症监护病房的护理、医疗和行政人员的支持。我们特别要感谢Imelda Mayor, RN;克莱尔·詹宁斯，注册护士;凯伦·道克瑞，注册护士;以及注册护士珍娜·希尔，感谢她对曼彻斯特圣玛丽医院新生儿重症监护室试验的支持;这些人除了他们的标准员工工资外，没有得到任何补偿。曼彻斯特基因组医学中心的研究支持团队对这项工作给予了极大的支持，我们对此表示感谢。我们感谢支持项目的指导、利益相关者和患者群体的成员。曼彻斯特大学国家卫生服务基金会的VOCAL团队创建了一个定制的患者和公众参与和参与计划，这对项目的成功至关重要。最后，我们感谢参与这次审判的家庭。